РЕФЕРАТ 2
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5
1.1 Характеристики ДНК, входящей в состав цитоплазматических ДНК–мембранных комплексов 5
1.2 Подходы к экстракции и очистке ДНК из клеток млекопитающих 6
1.3 Субклеточное фракционирование 8
1.3.1 Буферные системы, используемые для субфракционирования 10
1.4 Детергенты для экстракции и очистки ДНК 10
1.5 Депротонирование ДНК органическими методами 13
1.6 Концентрирование ДНК путем осаждения спиртом 14
1.7 Электрофорез нуклеиновых кислот 15
1.8 Спектрофотометрия препаратов ДНК 16
1.8.1 Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК 17
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 18
2.1 Получение препаратов геномной и цитоплазматической ДНК млекопитающих 18
2.2 Определение количества белка в препаратах ДНК 18
2.3 Определение молекулярных характеристик препаратов ДНК спектрофотометрическим методом 18
2.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле 18
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 20
3.1 Выделение цпДНК из клетки глиомы крыс 20
3.2 Молекулярные характеристики ДНК и способы их определения 22
3.2.1 Количественная и качественная оценка препаратов ДНК 23
3.2.2 Молекулярные характеристики ДНК 24
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 26
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 27
Выводы:
1. Использование анионного детергента NP-40 в концентрации до 0,5% позволило получить цитоплазматическую и интактную ядерную фракции из клеток глиомы крыс.
2. Разработан метод и при его использовании получены препараты цитоплазматической ДНК из клеток глиомы крыс.
3. Спектрофотометрическим методом и методом Лоури показано, что препараты цитоплазматической ДНК содержали до 20% белка и до 5% РНК.
4. Методом гельэлектрофореза установлено, что цитоплазматическая ДНК клеток глиомы крыс имеет линейную двуспиральную структуру, её молекулярная масса составляет 22 – 25 тыс. п.о.
1. Lerner, R. A. Membrane–associated DNA in the cytoplasm of diploid human lymphocytes / R. A. Lerner, W. Meinke, D. A. Goldstein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1971. – Vol.68, №6. – P. 1212.
2. Meinke, W. Physical properties of cytoplasmic membrane–associated DNA / R. A. Lerner, W. Meinke, D. A. Goldstein, M. R. Hall, D. E. Kohne // J. Mol. Biol. – 1973. – Vol. 78, №1. – P. 43–56.
3. Meinke, W. Reassociation and dissociation of cytoplasmic membrane–associated DNA / W. Meinke, D. A. Goldstein // J. Mol. Biol. – 1974. – Vol. 86, №4. – P. 757–773.
4. Tonutti, E. Cell lines that express membrane–associated DNA for anti–DNA antibody detection / E. Tonutti, N, Blasone, D. Visentini, M. Poletto, D. Villalta, R. Tozzoli, N. Bizzaro // Clin. Chem. Lab. Med. – 2008. – Vol. 46, №4. – P. 458–462.
5. Bennett, R. M. Anti DNA expressed on the surface of monocytes and B lymphocytes / R. M. Bennett, J. Davis, M. Merritt // J. Rheumatol. – 1986. – Vol. 13. – P. 679–685.
6. Bennett , R. M. DNA receptor dysfunction in systemic lupus erythematosus and kindred disorders. Induction by anti DNA antibodies, antihistone antibodies and antireceptor antibodies / R. M. Bennett , B. L. Kotzin, M. J. Merritt // J. Exp. Med. – 1987. – Vol. 166. – P. 850–863.
7. Servais, G. Eviddence of autoantibodies to cell membrane associated DNA (cultured lymphocytes): a nue cpesific marcer for rapid identification of systemic lupus erythematosus / G. Servais, M. P. Guillaume, N. Dumarey, J. Duchateau // Ann. Rheum. Dis. – 1998. – Vol. 57. – P. 606–613.
8. Mathew, C. The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA / C. Mathew // In Methods of Molecular Biology. – 1984. – Vol. 2. – P. 31–34.
9. Garner, I. Isolation of High–Molecular–Weight DNA from Animal Cells / I. Garner // The nucleic acid protocols handbook. – 2000. – Vol. 1. – P. 3–6.
10. Mendez, J. Chromatin association of human origin recognition complex, cdc6, and minichromosome maintenance proteins during the cell cycle: assembly of prereplication complexes in late mitosis / J. Mendez, B. Stillman // Mol Cell Biol. – 2000. – Vol. 20. – P. 8602–12.
11. Harford, J. B. Subcellular fractionation and isolation of organelles / J. B. Harford, J. S. Bonifacino // Curr Protocols Cell Biology. – 2011. – Vol. 52. – P. 301–308.
12. Servais, G. Eviddence of autoantibodies to cell membrane associated DNA (cultured lymphocytes): a nue cpesific marcer for rapid identification of systemic lupus erythematosus / G. Servais, M. P. Guillaume, N. Dumarey, J. Duchateau // Ann. Rheum. Dis. – 1998. – Vol. 57. – P. 606–6133.
13. Dounce, A.L. An improved method for prepairing sodium deoxypentose nucleate / A.L. Dounce, N.S. Simmons, R.M.A. Rey // Fed. Proc. – 1951. – Vol. 10, № 1. – P. 177 – 182.
14. Slater G.W. Recent developments in DNA electrophoretic separations / G.W. Slater, T.B. Kist, H. Ren, G. Drouin // Electrophoresis. – 1998. – Vol. 19. – N 10. – P 1525–1541.
15. Wilcockson, J. The Use of Sodium Perchlorate in Deproteinization During the Preparation of Nucleic Acids / J. Wilcockson // J. Biochem. – 1973. – Vol. 135. – P. 559–561.
16. Bowtell, D. D. Rapid Isolation of Eukaryotic DNA / D. D. Bowtell // Anal. Biochem. – 1987. – Vol. 162. – P. 463–465
17. 15. Graham, D. The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms or large tissue masses / D. Graham // Analytical Biochemistry. – 1978. – Vol. 85, № 2. – P. 609–613.
18. Остерман Л.А., Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование // Москва, Наука. – 1981. – 286 с.
19. Johnson P.H. Electrophoresis of DNA in agarose gels. II. Effects of loading mass and electroendosmosis on electrophoretic mobilities / P.H. Johnson, M.J. Miller, L.I. Grossman // Anal. Biochem. – 1980. – Vol. 102. – N 1. – P 159 – 162.
20. Мандель, М. Определение содержания гуанина и цитозина с помощью кривых плавления / М. Мандель, Дж. Мармур // Методы исследования нуклеиновых кислот. М.: Мир, 1970. – С. 183 – 191.
21. Черепненко, Е.И. Щадящий метод выделения ДНК из ядер клеток насекомых / Е.И. Черепненко, А.П. Галкин, В.Р. Лебедев, И.П. Кок // Укр. биохим. журнал. – 1982. – Т. 54, № 3. – С. 316 – 317.
22. Егорова, В.П. Определение содержания белковых примесей в препаратах ДНК высокой чистоты / В.П. Егорова, Д.Ю. Ландо, В.И. Крот, А.А. Ахрем // Молекулярная биология. – 1996. – Т. 30. – С. 701 – 706.
23. Karapetian, A.T. Theory of helix-coil transition on DNA-ligand complexes: the effect to two types of interaction of ligand on the parameters of transition / A.T. Karapetian, P.O. Vardevanian, G.A. Tarzikian, M.D. Frank-Kamenetskii // J. Biomol. Struct. Dyn. – 1990. – Vol. 8, №1. – P. 123 – 130.
24. Bennett, R. M. Anti DNA expressed on the surface of monocytes and B lymphocytes / R. M. Bennett, J. Davis, M. Merritt // J. Rheumatol. – 1986. – Vol. 13. – P. 679–685
25. Bingham, P.M. Cloning of DNA secuences from the white locus of D. melanogaster by a novel and general method / P.M. Bingham // Cell. - 1981. - Vol. 25. - P. 693-704.
26. Остерман, Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л. А. Остерман. М.: Наука, 1985. С. 168–220.
27. Мандель, М. Определение содержания гуанина и цитозина с помощью кривых плавления / М. Мандель, Дж. Мармур // Методы исследования нуклеиновых кислот. М.: Мир. - 1970. - С. 183-191.
28. Черепненко, Е.И., Щадящий метод выделения ДНК из ядер клеток насекомых / Черепненко, Е.И., Галкин А.П., Лебедев В.Р., Кок И.П. // Укр. биохим. журнал. – 1982. – Т. 54, № 3. – С. 316-317.
29. Karapetian, A.T. Theory of helix-coil transition on DNA-ligand complexes: the effect to two types of interaction of ligand on the parameters of transition / Karapetian A.T., Vardevanian P.O., Tarzikian G.A., Frank-Kamenetskii M.D // J. Biomol. Struct. Dyn. – 1990. – Vol. 8, №1. – P. 123-130.
30. Aguilera, A. A molecular approach to the characterization of the eukaryotic communities of an extreme acidic environment / A. Aguilera, F. Gómez, E. Lospitao [at al.] // Systematic and Applied Microbiology. – 2006. – Vol. 29. – № 7. – P. 593–605.
31. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. – М.: Мир, 1984. – 479 с.
32. Welsh, R. A method for the preparation of DNA from calf thymus nuclei in maximum purityand yield, analysis of theis DNA compared with that obtained by other methods / R. Welsh // Physiol. Chem. Phys. Med. MMR. – 1993. – Vol. 25. – P. 125–135.
33. Blin, N. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes / N.Blin, W.Stafford // Nucleic Acids Research. – 1976. – Vol. 3. – №9. – P. – 2303 – 2308.
34. Gross–Bellard, M. Isolation of high–molecular weight DNA from mammalian cells / M. Gross–Bellard, M. Oudet, P. Chambon // Eur. J. Biochem. – 1973. – Vol. 36. – P.32–38.
35. Kupiec, J.J. Isolation of high–molecular–weight DNA from eukaryotic cells by formamide treatment and dialysis / J.J. Kupiec, M.L. Giron, D.Vilette, J.M. Jeltsch [at al.] // Analytical Biochemistry. – 1987. – Vol. 164, № 1. – P. 53–59.
36. Metzger, H. The antigen receptor problem / H. Metzger // Annu. Rev. Biochem. – 1970. – Vol. 39. – P. 889.
37. Walters, C. S. Demonstration of heavy and light chain antigenic determinants on the cell–bound receptor for antigen. Similarities between membrane–attached and humoral antibodies produced by the same cell / C. S. Walters, J. Wigzell // J. Exp. Med. – 1970. – Vol.132, №6. – P. 1233.
38. Attardi, B. Membrane–bound ribosomes in HeLa cells. I. Their proportion to total cell ribosomes and their association with messenger RNA / B. Attardi, B. Cavioto, G. Attardi // J. Mol. Biol. – 1969. – Vol. 44, №1. – P. 47–70.
39. Glick, M. C. Membranes of animal cells. 3. Amino acid incorporation by isolated surface membranes / M.C. Glick, L. Warren // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1969. – Vol. 63, №2. – P. 563.
40. Bell, E. I–DNA: Its packaging into I–somes and its relation to protein synthesis during differentiation / E. Bell // Nature. – 1969. – Vol. 224, №5217. – P. 326.
41. Schneider, W. C. The association of deoxyribonucleic acid with liver microsomes / W. C. Schneider, E. L. Kuff // J. Biol. Chem. – 1969. – Vol. 244. – P. 4843.
42. Muller, W. E. G. Is "1–DNA" derived from nuclear DNA? / W. E. G. Muller, R. K. Zahn, R. Beyer // Nature. – 1970. – Vol. 227, №5264. – P. 1211.
43. Fromson, D. Cytoplasmic extraction: polyribosomes and heterogenous ribonucleoproteins without associated DN / D. Fromson, M. Nemer // Science. – 1970. – Vol. 168, №3928. – P. 266.
44. Bond, H. E. Microsome–associated DNA / H. E. Bond, J. A. Cooper, D. P. Courington, J. S. Wood // Science. – 1969. – Vol. 165, №3894. – P. 705.
45. Williamson, R. Properties of rapidly labelled deoxyribonucleic acid fragments isolated from the cytoplasm of primary cultures of embryonic mouse liver cells / R. Williamson // J. Mol. Biol. – 1970. – Vol. 51, №1. – P. 157.
46. Hudson, B. Catenated circular DNA molecules in HeLa cell mitochondria / B. Hudson, J. Vinograd // Nature. – 1967. – Vol. 216, №5116. – P. 647.
47. Clayton, D. A. Circular dimer and catenate forms of mitochondrial DNA in human leukaemic leucocytes / D. A. Clayton, J. Vinograd // Nature. – 1967. – Vol. 216, №5116. – P. 652.
48. Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures / B. Hirt // J. Mol. Biol. – 1967. – Vol. 26, №2. – P. 365.
49. Radloff, R. A dye–buoyant–density method for the detection and isolation of closed circular duplex DNA: the closed circular DNA in HeLa cells / R. Radloff, W. Bauer, J. Vinograd // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1967. – Vol. 57, №5. – P. 1514.
50. Warren, L. Membranes of animal cells / L. Warren, M. C. Glick, M. K. Nass // J. Cell. Physiol. – 1966. – Vol. 68. – P. 269.
51. Schildkraut, C. L. Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its buoyant density in CsCl / C. L. Schildkraut, J. Marmur, P. Doty // J. Mol. Biol. – 1962. – Vol. 4. – P. 430.
52. A. K. Kleinschmidt, R. K. Zahn // Z. Naturforsch. – 1959. – Vol. 14B. – P. 770.
53. Corneo, G. Human mitochondrial DNA / G. Corneo, L. Zardi, E. Polli // J. Mol. Biol. – 1968. – Vol. 36, №3. – P. 419.
54. Williams, C. O. Deoxyribonucleic acid base compositions of selected mycoplasmas and L–phase variants / C. O. Williams, R. G. Wittler, C. Burris // J. Bacteriol. – 1969. – Vol. 99, №1. – P. 341.
55. McGee, Z. A. Molecular genetic studies of relationships among mycoplasma, L–forms and bacteria / Z. A. McGee, M. Rogul, R. G. Wittler // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 1967. – Vol. 143, №1. – P. 21.
56. Hayflick, L. Isolation and identification of mycoplasma from human clinical materials / L. Hayflick, E. Stanbridge // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 1967. – Vol. 143, №1. – P. 608.
57. Jacob, F. Genetics of the bacterial cell / F. Jacob // Science. – 1966. – Vol. 152, №3728. – P. 1470.
58. Jacob, F. Plasmid replication and partition in Escherichia coli: is the cell membrane the key? / F. Jacob, S. Brenner, F. Cuzin // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. – 1963. – Vol. 28, №1. – P. 329.
59. Krueger, R. G. Hybridization studies with nucleic acids from murine plasma cell tumors / B. J. McCarthy // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1970. – Vol. 41, №4. – P. 944.
60. Nomura, M. Colicins and related bacteriocins / M. Nomura // Annu. Rev. Microbiol. – 1967. – Vol. 21. – P. 257.
