РЕФЕРАТ 2
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Характеристика ДНК, входящей в состав цитоплазматических ДНК-мембранных комплексов 6
1.2 Теоретические основы горизонтального электрофореза 7
1.3 Электрофорез в агарозном геле 9
1.3. Миграция ДНК в агарозном геле 10
1.4 Подготовка и проведение электрофореза 15
1.4.1 Приготовление агарозного геля 15
1.4.2 Подготовка и нанесение проб 16
1.4.3. Окраска и фиксация 18
1.4.4 Буферные растворы 19
1.4.5 Буфер для проб 20
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 21
2.1 Получение препаратов геномной и цитоплазматической ДНК млекопитающих 21
2.2 Определение количества белка в препаратах ДНК 21
2.3 Определение молекулярных характеристик препаратов ДНК спектрофотометрическим методом 21
2.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле 21
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 23
3.1 Влияние условий гельэлектофореза на электрофоретическую подвижность фрагментов ДНК маркера Lambda DNA/HindIII 23
3.2 Определение структуры и молекулярной массы цпДНК 26
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 29
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 30
Выводы:
1. Использование анионного детергента NP-40 позволило выделить цитоплазматическую мембраноассоциированную ДНК из клеток глиомы крыс.
2. Спектрофотометрическим методом и методом Лоури показано, что препараты цитоплазматической ДНК содержали до 20% белка и до 5% РНК.
3. Установлено, что оптимальными условиями гель-электрофореза для определения молекулярной массы цитоплазматической ДНК являются: гель 1,2%, напряжение 70V, температура 10 оС, время 4 часа. ДНК маркер - λ/Hind III; количество маркера, наносимого в лунку – 0,3 мкг.
4. Методом гель-электрофореза установлено, что цитоплазматическая ДНК имеет линейную двуспиральную структуру, её молекулярная масса составляет 22 – 25 тыс. п.о.
1. Bustamante C. Towards a molecular description of pulsed-field gel electrophoresis / C. Bustamante, S. Gurrieri, S.B. Smith // Trends biotechnol. – 1993. – Vol. 11, N 1. – P. 23 – 30.
2. Slater G.W. Recent developments in DNA electrophoretic separations / G.W. Slater, T.B. Kist, H. Ren, G. Drouin // Electrophoresis. – 1998. – Vol. 19. – N 10. – P 1525-1541.
3. Lerner, R. A. Membrane-associated DNA in the cytoplasm of diploid human lymphocytes / R. A. Lerner, W. Meinke, D. A. Goldstein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1971. – Vol.68, №6. – P. 1212.
4. Meinke, W. Physical properties of cytoplasmic membrane-associated DNA / R. A. Lerner, W. Meinke, D. A. Goldstein, M. R. Hall, D. E. Kohne // J. Mol. Biol. – 1973. – Vol. 78, №1. – P. 43-56.
5. Meinke, W. Reassociation and dissociation of cytoplasmic membrane-associated DNA / W. Meinke, D. A. Goldstein // J. Mol. Biol. – 1974. – Vol. 86, №4. – P. 757-773.
6. Tonutti, E. Cell lines that express membrane-associated DNA for anti-DNA antibody detection / E. Tonutti, N, Blasone, D. Visentini, M. Poletto, D. Villalta, R. Tozzoli, N. Bizzaro // Clin. Chem. Lab. Med. – 2008. – Vol. 46, №4. – P. 458-462.
7. Bennett, R. M. Anti DNA expressed on the surface of monocytes and B lymphocytes / R. M. Bennett, J. Davis, M. Merritt // J. Rheumatol. – 1986. – Vol. 13. – P. 679–685.
8. Bennett , R. M. DNA receptor dysfunction in systemic lupus erythematosus and kindred disorders. Induction by anti DNA antibodies, antihistone antibodies and antireceptor antibodies / R. M. Bennett , B. L. Kotzin, M. J. Merritt // J. Exp. Med. – 1987. – Vol. 166. – P. 850–863.
9. Servais, G. Eviddence of autoantibodies to cell membrane associated DNA (cultured lymphocytes): a nue cpesific marcer for rapid identification of systemic lupus erythematosus / G. Servais, M. P. Guillaume, N. Dumarey, J. Duchateau // Ann. Rheum. Dis. – 1998. – Vol. 57. – P. 606-613.
10. Slater G.W. Theory of DNA electrophoresis: a look at some current challenges / G.W. Slater, C. Desruisseaux, S.J. Hubert, J.F. Mercier, J. Labrie, J. Boileau, F. Tessier, M.P. Pepin // Electrophoresis. – 2000. – Vol. 21. – N 18. – P 3873 – 3887.
11. Molinari M. Analyzing cotranslational protein folding and disulfide formation by diagonal sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis / M. Molinari, A. Helenius // Methods Enzymol. – 2002. – Vol. 348. – P 35-42.
12. Slater G.W. Theory of DNA electrophoresis / G.W. Slater, S. Guillouzic, M.G. Gauthier, J.F. Mercier, M. Kenward, L.C. McCormick, F. Tessier // Electrophoresis. – 2002. – Vol. 23 (22-23). – P 3791 – 816.
13. Zeman S.M. Simultaneous measurement of binding constants and unwinding angles by gel electrophoresis / S.M. Zeman, D.M. Crothers // Methods Enzymol. – Vol. 340. – P 51 – 68.
14. Slater G.W. The theory of DNA separation by capillary electrophoresis. / G.W. Slater, M. Kenward, L.C. McCormick, M.G. Gauthier // Curr Opin Biotechnol. – 2003. – Vol. 14. – N 1. – P 58 – 64.
15. Rodbard D. Unified theory for gel electropho¬resis and gel filtration / D. Rodbard, A. Chrambach // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1970. – Vol. 65. – N 4. – P 970 – 977.
16. Галь Э., Медьеши Г., Верецкеи Л., Электрофорез в разделении биологических макромолекул // Москва, Мир. – 1982. – 446 с.
17. Ackers G.K. Restricted diffusion of macromolecules through agar-gel membranes / G.K. Ackers , R.L. Steere // Biochim. Biophys. Acta. – 1962. – Vol. 59. – N 1. – P 137 – 149.
18. Остерман Л.А., Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование // Москва, Наука. – 1981. – 286 с.
19. Щукин Е.Д., Перцов А.В., Амелина Е.А., Коллоидная химия // Москва, ВШ. – 2006. – С. 162 – 194.
20. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии // Ленинград, Химия. – 1974. – С. 192 – 236.
21. Johnson P.H. Electrophoresis of DNA in agarose gels. II. Effects of loading mass and electroendosmosis on electrophoretic mobilities / P.H. Johnson, M.J. Miller, L.I. Grossman // Anal. Biochem. – 1980. – Vol. 102. – N 1. – P 159 – 162.
22. Schwartz D.C. Conformational Dynamics of Individual DNA Molecules During Gel Electrophoresis / D.C. Schwartz, M. Koval // Nature. – 1989. – Vol. 338. – N 6215. – P 520 – 522.
23. Gurrieri S. Trapping of megabase DNA molecules during agarose gel electrophoresis / S. Gurrieri, S. B. Smith, C. Bustamante // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1999. – Vol. 96. – N 2. – P 453 – 458.
24. Gurrieri S. Purification and staining of intact yeast DNA chromosomes and real-time abservation of their migration during gel electrophoresis / S. Gurrieri, C. Bustamante // Biochem. J. – 1997. – Vol. 326. – N 1. – P 131 – 138.
25. Маниатис Т., Э. Фрич, Дж. Сэмбрук, Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // М.: Мир. – 1984. – 478 с.
26. Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) / J. Sambrook, D. Russell // CSHL Press. – 2001. – Р 2344.
27. Overbeek J. T. G. The interpretation of electrophoretic mobilities / J. T. G. Overbeek, P. H. Wiersema // in Electrophoresis. – 1967. – Vol. 2. – Р 1 – 41.
28. Peacock A.C. Molecular Weight Estimation and Separation of Ribonucleic Acid by Electrophoresis in Agarose- Acrylamide Composite Gels / A.C. Peacock, C.W. Dingman // Biochemistry. – 1968. – Vol. 7. – N 2. – P 668 – 674.
29. Dahlberg A.E. Electrophoretic Characterization of Bacterial Polyribosomes in Agarose-Acrylamide Composite Gels / A.E. Dahlberg, C.W. Dingman, A.C Peackok. // J. Mo1. Bio. l. – 1969. – Vol. 41. – N 1. - P 139 – 147.
30. Dahlberg A.E. Some Effects of Antibiotics on Bacterial Polyribosomes as Studied by Gel Electrophoresis / A.E. Dahlberg, Lund E., Kjeldgaard N.O. // J. Mol. Bio. l. – 1973 - Vol.78. – N 4. – P 627 – 636.
31. Overbeek, J. T. G., and Lijklema, J. (1959) in Electrophoresis, Vol. 1, Edit. Bier, M., Academic, New York, p. 1 – 33.
32. Chrambach A. Polyacrylamide gel electrophoresis / A. Chrambach, D. Rodbard // Science. – 1971– Vol.172. – N 982. – P 440 – 451.
33. Yuan C. Comprehensive Interpretation of Gel Electrophoresis Data / C. Yuan, E. Rhoades, D.M. Heuer, S. Saha, X.W. Lou, L.A. Archer // Analytical Chemistry. – 2006. – Vol. 78. – N 17. – P 6179 – 6186.
34. Panyim S. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones / S. Panyim, R. Chalkley // Arch Biochem Biophys. – 1969. – Vol. 130. – N 1. – P 337 – 346.
35. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. – 1970. – Vol. 227. – N 5259. – P 680 – 685.
36. Gromova I. Protein Detection in Gels by Silver Staining: A Procedure Compatible with Mass-Spectrometry / I. Gromova, J.E. Celis // in Cell Biology: A Laboratory Handbook. – 2006. – Vol. 4
37. McLellan T. Electrophoresis buffers for polyacrylamide gels at various pH / T. McLellan // Anal Biochem. – 1982. – Vol. 126. – N 1. – P 94 – 99.
